靶向小鼠Rbmy基因的CRISPR/Cas9系统高效切割位点筛选及其表达载体构建

性反转是指动物表现的性别特征与其应有的性别相反的现象。性反转小鼠可作为动物模型研究哺乳动物性别分化机制、性别控制技术以及研究人类性别连锁疾病发病机理和防治方法。已有研究证明,在胚胎期敲除雄性小鼠的Y染色体将获得XO基因型的性反转小鼠。本研究设计了6个不同的sgRNA,使共能介导Cas9蛋白作用于小鼠Y染色体上的多拷贝基因—Rbmy(RNA-binding motif gene),通过比较不同的sgRNA介导Cas9对靶序列的切割效率,最终筛选出一条能够高效介导Cas9靶向Rbmy基因的sgRNA6,该sgRNA6在体外切割效率达到100%,细胞内切割突变效率为15.4%,利用该sgRNA6构建了靶向Rbmy基因的CRISPR/Cas9系统表达载体。利用该载体转染小鼠雄性睾丸间质瘤细胞,成功获得了XO基因型的单细胞克隆团。本研究所构建的靶向Rbmy基因的CRISPR/Cas9系统表达载体可用于小鼠胚胎注射,为获得Y染色体敲除的XO型性反转小鼠模型提供基础。